Ngày 26 tháng 3 năm 1564, Knox gây xôn xao dư luận khi kết hôn với Margaret Stewart, một người có họ hàng xa với Mary Stuart.[52] Cuộc hôn nhân bị xem là bất thường vì sự cách biệt tuổi tác giữa Knox và Margaret.

Trong mười bốn tháng kế tiếp, Knox hầu như sống ẩn dật, có lẽ do tuổi già và mệt mỏi với những tranh chấp chính trị.

Ngày 9 tháng 3 năm 1566, thư ký của Mary, David Rizzio, bị các nhà quý tộc Kháng Cách ám sát. Mary trốn đến Dunbar, và ngày 18 tháng 3 quay về Edinburg với một đạo quân hùng hậu. Knox trốn đến Kyle thuộc Ayshire. Tại đây, ông hoàn thành phần chính của tác phẩm Lịch sử Cải cách Scotland.[53]

Sau khi trở về từ Kyle, Knox nhận thấy các nhà quý tộc Kháng Cách đang bất đồng với nhau về cách đối xử với Mary, hiện bị giam giữ ở Lâu đài Loch Leven. Bạn cũ của Knox, James Stewart đang là nhiếp chính cho tân vương James VI. Ngày 2 tháng 5 năm 1568, Mary trốn thoát.

Vẫn tiếp tục diễn ra những tranh chấp ở Scotland. Ngày 23 tháng 1 năm 1570, James Stewart bị ám sát. Hai nhiếp chính kế tiếp cũng là nạn nhân của tình trạng bạo động.

Ngày 9 tháng 11 năm 1572, sau khi chỉ định người kế nhiệm tại Nhà thờ St Giles, Knox về nhà lần cuối. Trong sự hiện diện của bằng hữu và các nhà quý tộc, Knox yêu cầu được nghe đọc Kinh Thánh. Ngày 24 tháng 11 năm 1572, Margaret đọc cho chồng nghe Thư thứ nhất Phao-lô gởi tín hữu Corinth.[54] Tại phần mộ của Knox trong nghĩa trang Nhà thờ Giles, James Douglas, Bá tước Morton, cũng là nhiếp chính Scotland, nhận xét về Knox: